Bei dem Versuch, ihren Bananenhort vor dem bösen King K. Rool zu retten, arbeiten Donkey Kong und Diddy Kong als Team - du steuerst immer nur einen von beiden, kannst aber jederzeit wechseln (oder dich mit einem Freund abwechseln). Donkey ist ein großer Kerl - große Fäuste, muskulöse Beine, die besonders hohe Sprünge ermöglichen, und er kann Fässer ebenso wie Kokosnüsse mit Leichtigkeit herumschleudern. Diddy ist kleiner, schneller, ein besserer Schwimmer, der auch weiter springen kann und Fässer vor sich her trägt, um sich vor den Kremling-Horden des Königs zu schützen. Um erfolgreich zu sein, musst du die Stärken der beiden Affen nutzen. Donkey kann seinen Ground Slap einsetzen, um lästige Klaptrap-Babyalligatoren umzudrehen, oder mit seinem Furcht einflößenden Roll über Plattformen donnern. Diddy kann sich ducken, um den Angriffen riesiger Bienen zu entgehen, er kann mit Cartwheel Jumps an Bonusleben-Ballons herankommen, und dank seiner geringeren Größe kann er bei Fahrten in Bergwerksloren katastrophale Zusammenstöße mit Gegnern vermeiden. Genauso wichtig ist es allerdings, die Schwächen der beiden Affen zu kennen - denn wenn Donkey oder Diddy ausfällt, bist du ganz auf den anderen angewiesen, bis du den Gestrauchelten mit einem DK-Fass zurückholen kannst.